Rregullimet për ndonjë nga komponentët e një reaksioni të Reaksionit të Zinxhirit Polymerase (PCR) mund të ndryshojnë cilësinë e rezultatit, ose duke përmirësuar ose zvogëluar prodhimin dhe cilësinë e produktit ose duke përmirësuar specifikën dhe ndjeshmërinë e reaksionit. Parametrat që ndikojnë në rezultatin përfundimtar mund të jenë fizike (dmth., Temperatura, cikli) ose kimike (dmth. Përqendrimi i modelit, lloji i enzimit të përdorur). Më poshtë janë disa faktorë kryesorë që ndikojnë në suksesin e PCR.
01 Kushtet e pastra laboratorike
Meqenëse PCR është e aftë të zbulojë një molekulë të vetme të ADN-së, është e rëndësishme të ruhen kushtet e pacenuar në laborator. Gjithmonë mbani dorashka të freskëta, përdorni qelqe sterile, tuba dhe këshilla pipeti dhe zgjidhje sterile, dhe pastroni zonën e punës para fillimit të punës.
Gjithmonë përfshini reaksione kontrolli, pa template DNA dhe pa enzimë, për të siguruar që rezultatet janë me të vërtetë për shkak të përforcimit të mostrës së duhur.
Shumica e njerëzve sigurohen që të kenë një sërë zgjidhjesh të tyre që nuk janë të përbashkëta për të bërë më të lehtë zgjidhjen e problemeve dhe pipetat e përcaktuara shpesh janë lënë mënjanë vetëm për PCR. Tubat PCR pa DNase dhe RNase, këshilla pipetash rezistente ndaj aerosoleve dhe duke punuar në një kapuç të nxehtë me drita UV janë gjithashtu mënyra për të minimizuar problemet.
02 Përbërësit kimikë
- Keni 18 deri në 24 baza
- Mos kini asnjë strukturë dytësore (p.sh., unazore me shirita)
- Kanë shpërndarje të ekuilibruar të çifteve G / C dhe A / T
- Nuk janë komplementare me njëri-tjetrin në fundin 3-këmbë
- Kanë temperatura të shkrirjes (Tm) rreth 5-10 gradë Celsius poshtë temperaturës së pjekjes, e cila zakonisht është midis 55 dhe 65 gradë Celsius
Tm për të dy abetarët duhet gjithashtu të jetë i ngjashëm për rezultatet më të mira.
03 Reagimi Mix: Template dhe Primers
Përqendrimet optimale të primerit janë ndërmjet 0.1 dhe 0.6 mikromol / L. Shuma e modelit ndryshon në varësi të llojit të ADN-së (njerëzore, bakteriale, plazmidi).
Me sasi shumë të ulëta të modelit, ekzistojnë strategji të tjera për të përmirësuar rezultatet, si numrat e ciklit të rritur ose përdorimi i "fillimit të nxehtë". Gjithmonë testoni abetaret e rinj me një reagim pozitiv të kontrollit, për t'u siguruar që ata punojnë sipas kushteve specifike eksperimentale.
04 Mix Reagimi: Aktiviteti enzimë
Përqendrimi i MgCl2 në përzierjen e reagimit mund të ndikojë në rezultatin e PCR dhe mund të luajë një rol të rëndësishëm në reagimet më të shpejta. Kationi i magnezit formon komplekset e tretshme me dNTPs për të prodhuar substratin aktual që enzimi i polimerazës njeh.
Sasi të barabarta të të katërve dNTPs gjithashtu ndihmojnë në uljen e shkallës së gabimit të polimerazës. Disa aditivë të tillë si betaina, BSA, detergjentet, DMSO, gliceroli dhe pirofosfataza gjithashtu mund të ndikojnë në specifikat e enzimeve ose në efikasitetin e reaksionit.
05 Lloji i termociklerit
Kur pazaret për pajisje laboratorike, mbani në mend se disa thermocyclers janë më pak të sakta se të tjerët në ruajtjen e saktë, temperaturat e dëshiruara.
Kjo është një fushë ku shkon lirë nuk do të paguajë në afat të gjatë, kur ju jeni përballur me një reagim finicky ose duke përdorur abetare që kërkojnë një gamë të ngushtë të temperaturë annealing.
Tubat reaguese me hollë të projektuar për të përshtatur markën e saktë të termociklerit që po përdorni, gjithashtu ndihmojnë në optimizimin e temperaturave të reagimit.
06 Cilësimet e ciklit
Rritja e rendimentit mund të arrihet duke rritur kohën e zgjatjes për çdo 20 cikle, për të kompensuar më pak enzimë për të përforcuar më shumë shabllon. Zakonisht, më pak se 40 cikle janë të mjaftueshme për të përforcuar më pak se 10 molekula template në një përqendrim të madh të mjaftueshme për të parë në një xhel me agaroz të ngjyrosur me bromid etidium .