Klonimi i gjeneve është akti i bërjes së kopjeve, ose kloneve, të një gjeneti të vetëm. Pasi të identifikohet një gjen, klonet mund të përdoren në shumë fusha të hulumtimeve biomjekësore dhe industriale. Inxhinieria gjenetike është procesi i klonimit të gjeneve në organizma të rinj ose ndryshimi i sekuencës së ADN-së për të ndryshuar produktin e proteinave. Inxhinieria gjenetike varet nga aftësia jonë për të kryer procedurat e mëposhtme thelbësore.
01 Reaksioni i zinxhirit polimeraz
02 Enzimat e kufizimit
Zbulimi i enzimeve të njohura si endonukleaza kufizuese ka qenë thelbësore për inxhinieri e proteinave . Këto enzime e prenë ADN-në në vende të veçanta bazuar në sekuencën nukleotide. Qindra enzima të ndryshëm të kufizimit , të aftë për të prerë ADN-në në një vend të dallueshëm, janë izoluar nga shumë lloje të ndryshme të baktereve. ADN-ja e prerë me një enzimë kufizuese prodhon shumë fragmente të vogla, me madhësi të ndryshme. Këto mund të ndahen duke përdorur electrophoresis xhel ose chromatography.
03 Elektroforezë
Pastrimi i ADN nga një kulturë qelizore, ose prerja e tij duke përdorur enzimat e restrikcioneve nuk do të ishte shumë e dobishme nëse nuk mund ta paramendonim ADN-në - gjegjësisht të gjejmë një mënyrë për të parë nëse ekstrakti yt përmban ndonjë gjë ose çfarë madhësie të fragmenteve e kam prerë atë. Një mënyrë për ta bërë këtë është elektroforeza e xhelit. Gels përdoren për qëllime të ndryshme, nga shikimi i ADN-së të prerë për zbulimin e inserteve dhe knockout-it të ADN-së.
04 Bashkohen dy pjesë të ADN-së
Në hulumtimin gjenetik, shpesh është e domosdoshme lidhja e dy ose më shumë fijeve individuale të ADN-së, për të krijuar një fillesë rekombinante ose për të mbyllur një fillesë rrethore që është prerë me enzima kufizuese. Enzimat të quajtur ligaze të ADN-së mund të krijojnë lidhje kovalente midis zinxhirëve të nukleotideve. Enzimat ADN polimeraza I dhe polinukleotid kinaza janë gjithashtu të rëndësishme në këtë proces, për mbushjen e boshllëqeve ose fosforilizimin e përfundimeve 5 ', respektivisht.
05 Përzgjedhja e ADN-së së vogël Vetë-Replikuese
Pjesët e vogla të rrethit të ADN-së që nuk janë pjesë e një gjenomi bakterial, por që janë të aftë të vetë-përsëriten, njihen si plazmide. Plazmidet shpesh përdoren si vektorë për të transportuar gjene midis mikroorganizmave. Në bioteknologji, pasi gjen i interesit është përforcuar dhe si gjen dhe plasmid janë prerë nga enzimat e restrikcioneve, ata janë të lidhur së bashku duke gjeneruar atë që njihet si një ADN rekombinant. Viral (bakteriofag) ADN mund të përdoret gjithashtu si një vektor, ashtu si kozmidet, plazmidat rekombinantë që përmbajnë gjene bakterofage.
06 Metoda për të zhvendosur një Vector në një Cell Host
Procesi i transferimit të materialit gjenetik në një vektor të tillë si një plasmid, në qeliza të reja pritëse quhet transformim. Kjo teknikë kërkon që qelizat pritëse të ekspozohen ndaj një ndryshimi mjedisor, që i bën ata "kompetent" ose përkohësisht të depërtueshëm ndaj vektorit. Elektroporacioni është një teknikë e tillë. Sa më i madh të jetë plasmidi, aq më e ulët është efikasiteti me të cilin merret qeliza. Segmente më të mëdha të ADN-së janë më të lehtë të klonuara duke përdorur bakterofag, retrovirus ose vektorë të tjerë viralë ose kozmide në një metodë të quajtur transduksioni. Fag ose vektor viral shpesh përdoren në mjekësinë rigjeneruese, por mund të shkaktojnë futjen e ADN-së në pjesë të kromozomeve tona, ku ne nuk duam, duke shkaktuar komplikime dhe madje edhe kancer.
07 Metodat për përzgjedhjen e organizmave transgjenikë
Jo të gjitha qelizat do të marrin ADN-në gjatë transformimit. Është thelbësore që të ekzistojë një metodë për të zbuluar ato që bëjnë. Në përgjithësi, plazmidet bartin gjene për rezistencën antibiotike dhe qelizat transgenike mund të zgjidhen bazuar në shprehjen e atyre gjeneve dhe aftësinë e tyre për t'u rritur në median që përmban këtë antibiotik. Metodat alternative të përzgjedhjes varen nga prezenca e proteinave të tjera raportuese si sistemi x-gal / lacZ ose proteina e gjelbër fluoreshente, të cilat lejojnë seleksionimin bazuar në ngjyrën dhe ndriçimin fluoreshent.