Shkalla e pastërtisë së proteinave të kërkuar varet nga përdorimi i planifikuar përfundimtar i proteinës.
Për disa aplikacione, një ekstrakt i papërpunuar është i mjaftueshëm. Megjithatë, për përdorime të tjera, të tilla si në ushqime dhe produkte farmaceutike, kërkohet një nivel i lartë pastërti. Për të arritur këtë, disa metoda të pastrimit të proteinave zakonisht përdoren, në një seri hapash të pastrimit.
Çdo hap i pastrimit të proteinave zakonisht rezulton në një shkallë humbjeje të produktit. Prandaj, një strategji ideale e pastrimit të proteinave është ajo në të cilën arrihet niveli më i lartë i pastrimit në hapat më pak. Zgjedhja e të cilave hapa për t'u përdorur varet nga madhësia, ngarkesa, solubiliteti dhe vetitë e tjera të proteinës së synuar. Teknikat e mëposhtme janë më të përshtatshme për pastrimin e një proteine të vetme citosolike. Pastrimi i komplekseve proteinike citosolike është më i ndërlikuar dhe zakonisht kërkon që të zbatohen metoda të ndryshme.
Hapat e parë për pastrimin e proteinave
Hapi i parë në pastrimin e proteinave intracelulare (brenda qelizës) është përgatitja e një ekstremi të papërpunuar .
Ekstrakti do të përmbajë një përzierje komplekse të të gjitha proteinave nga citoplazma e qelizës, dhe disa makromolekula shtesë, kofaktorët dhe ushqyesit. Ekstrakti i papërpunuar mund të përdoret për disa aplikime në bioteknologji, megjithatë, nëse pastërtia është një çështje, duhet të ndiqen hapat e mëvonshëm të pastrimit.
Ekstraktet e proteinave të papërpunuara përgatiten me heqjen e mbeturinave qelizore të gjeneruara nga liza qelizore, e cila arrihet duke përdorur kimikate dhe enzime , sonication ose një Press frëngjisht. Mbeturinat hiqen me centrifugim dhe supernatanti është rikuperuar. Përgatitjet bruto të proteinave ekstracelulare mund të merren thjesht duke hequr qelizat me centrifugim.
Për aplikime të caktuara të bioteknologjisë ekziston një kërkesë për enzimat termostabile : Enzimat që mund të tolerojnë temperaturat e larta pa denaturë dhe duke ruajtur një aktivitet të lartë specifik. Organizmat që prodhojnë ato nganjëherë quhen ekstremofile. Një qasje e lehtë për pastrimin e një proteine rezistente ndaj nxehtësisë është të denatizojë proteinat e tjera në përzierje duke ngrohur, pastaj duke e ftohur atë zgjidhje (duke lejuar kështu enzimat e termostabilit të reformohen ose të rigjenerohen, nëse është e nevojshme.) Proteinat e denatyruara mund të hiqen me centrifugim.
Hapat e pastrimit të ndërmjetëm
Në të kaluarën, një hap i dytë i përbashkët për pastrimin e një proteine nga një ekstrakt i papërpunuar ishte nga reshjet në një zgjidhje me forcë të lartë osmotike (dmth. Zgjidhje kripë). Acidet nukleike në ekstraktin e papërpunuar mund të hiqen duke precipituar agregatet e formuara me sulfat streptomicin ose sulfat protamin.
Reshjet e proteinave zakonisht bëhen duke përdorur sulfat amoniak si kripë.
Proteina të ndryshme do të precipitojnë në përqëndrime të ndryshme të sulfatit të amonit . Në përgjithësi, proteinat me peshë më të lartë molekulare precipitojnë në përqëndrime të ulëta të sulfatit të amonit. Reshjet e kripës zakonisht nuk çojnë në një proteinë shumë të pastruar, por mund të ndihmojnë në eliminimin e disa proteinave të padëshiruara në një përzierje dhe përqëndrimin e mostrës. Kripërat në zgjidhje pastaj hiqen me anë të dializës përmes tubave të celulozës poroze, filtrimit ose kromatografisë me përjashtim të xhelit.
Protokollet moderne të bioteknologjisë shpesh përfitojnë nga shumë kite komerciale që ofrojnë zgjidhje të gatshme për procedurat standarde. Pastrimi i proteinave kryhet shpesh duke përdorur filtra dhe duke përgatitur kolona të filtrimit të xhelit. Të gjithë duhet të bëni është të ndiqni udhëzimet dhe të shtoni vëllimin e duhur të zgjidhjes së duhur dhe të prisni kohëzgjatjen e caktuar gjatë mbledhjes së eluantit (çfarë del nga fundi tjetër i kolonës) në një provë të re.
- Metodat kromatografike mund të aplikohen duke përdorur shtylla tavoline ose pajisje të automatizuara HPLC. Ndarja nga HPLC mund të bëhet me anë të fazës së kundërt, shkëmbimit të joneve ose metodave të përjashtimit të madhësisë dhe mostrave të zbuluara me anë të rrjetit diodë ose teknologjisë lazer.
Vizualizimi i proteinave dhe vlerësimi i pastrimit
- Kromatografia në fazën e prapme (RPC) ndan proteinat bazuar në hidrofobicitetin e tyre përkatës. Kjo teknikë është shumë selektive, por kërkon përdorimin e tretësve organikë. Disa proteina denaturohen përgjithmonë nga tretësit dhe humbasin funksionalitetin gjatë RPC. Prandaj kjo metodë nuk rekomandohet për të gjitha aplikimet, veçanërisht nëse është e nevojshme që proteina e synuar të mbajë aktivitetin.
- Kromatografi jon-shkëmbimi i referohet ndarjes së proteinave bazuar në ngarkesë . Kolonat mund të përgatiten për shkëmbimin anion ose shkëmbimin e kationeve. Shtyllat e shkëmbimit të anionit përmbajnë një fazë stacionare me një ngarkesë pozitive që tërheq proteina të ngarkuara negativisht. Kolonat e shkëmbimit të kationeve janë të kundërta, rruaza të ngarkuara negativisht që tërheqin proteina të ngarkuara pozitivisht. Eluacioni i proteinave të synuar bëhet duke ndryshuar pH në kolonë, gjë që rezulton në një ndryshim ose neutralizim të grupeve të ngarkuara funksionale të çdo proteine.
- Kromatografia me përjashtim të madhësisë ( filtrimi me xhel ) ndan proteinat më të mëdha nga ato të vogla, meqenëse molekulat më të mëdha udhëtojnë më shpejt përmes polimerit të ndërlidhur në kolonën e kromatografisë. Proteinat e mëdha nuk përshtaten në poret e polimerit, ndërsa proteina të vogla bëjnë dhe zgjasin më shumë për të udhëtuar nëpër kolonën e kromatografisë, nëpërmjet rrugës së tyre më pak të drejtpërdrejtë. Eluati mblidhet në një seri tubash që ndanë proteinat bazuar në kohën e elucionit. Filtrimi me xhel është një mjet i dobishëm për përqëndrimin e një kampioni proteinash pasi që proteinat e synuara janë grumbulluar në një vëllim më të vogël eluence sesa fillimisht i është shtuar kolonës. Teknika të ngjashme të filtrimit mund të përdoren gjatë prodhimit të proteinave në shkallë të gjerë për shkak të efektivitetit të tyre në kosto.
- Kromatografia Affinity është një teknikë shumë e dobishme për "lustrim" ose përfundimin e procesit të purifikimit të proteinave. Rruazat në kolonën e kromatografisë janë të ndërlidhura me ligandat që lidhen posaçërisht me proteinën e synuar. Proteina pastaj hiqet nga kolona duke u shpëlarë me një solucion që përmban ligandë të lirë. Kjo metodë jep rezultatet më të pastra dhe aktivitetin më të lartë specifik në krahasim me teknikat e tjera.
- SDS-PAGE është elektroforezë me poliakrilamid, i kryer në prezencë të SDS (natriumi dodecil sulfat) i cili lidhet me proteinat duke u dhënë atyre një ngarkesë të madhe negative neto. Meqenëse akuzat e të gjithë proteinave janë mjaft të barabarta, kjo metodë i ndan pothuajse tërësisht në bazë të madhësisë. SDS-PAGE përdoret shpesh për të testuar pastërtinë e proteinave pas çdo hapi në një seri. Pasi që proteinat e padëshiruara largohen gradualisht nga përzierja, numri i brezave të paraqitura në xhel SDS-PAGE reduktohet, derisa të ketë vetëm një brez që përfaqëson proteinën e dëshiruar.
- Imunoblotimi është një teknikë e vizualizimit të proteinave e aplikuar në kombinim me kromatografinë e afinitetit. Antitrupat për një proteinë specifike përdoren si ligandë në një kolonë kromatografie të afinitetit. Proteina e shënjestruar mbahet në kolonë, pastaj hiqet me anë të shpëlarjes së kolonës me një solucion kripë ose agjentë të tjerë. Antitrupat e lidhura me etiketat radioaktive ose ngjyrosje ndihmojnë në zbulimin e proteinës së synuar sapo ajo të ndahet nga pjesa tjetër e përzierjes.
burimet:
Zubay G. 1988. Biokimi, botimi i dytë. Macmillan Publishing Co., Nju Jork, NY, SHBA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Doracaku për pastrimin e proteinave, botimi AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, SHBA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.