Çfarë PCR ka të bëjë me sekuencën dhe amplifikimin e gjeneve të ADN-së
Reaksioni i zinxhirit polimerazë ( PCR ) është një teknikë molekulare gjenetike për të bërë kopje të shumëfishta të një gjeni dhe është gjithashtu pjesë e procesit të sekuencimit të gjeneve.
Si funksionon reagimi i zinxhirit polimerazë?
Kopjet e gjeneve bëhen duke përdorur një mostër të ADN-së, dhe teknologjia është mjaft e mirë për të bërë kopje të shumëfishta nga një kopje e vetme e gjenit të gjetur në mostër. Përforcimi i PCR i një gjeni për të bërë miliona kopje, lejon zbulimin dhe identifikimin e sekuencave të gjeneve duke përdorur teknika vizuale bazuar në madhësinë dhe ngarkimin (+ ose -) të pjesës së ADN-së.
Nën kushte të kontrolluara, segmentet e vogla të ADN-së gjenerohen nga enzimat e njohur si polimeraza e ADN-së, që shtojnë deoksinukleotide kompliment (dNTPs) në një pjesë të ADN-së të njohur si "template". Edhe pjesët më të vogla të ADN-së, të quajtura "primers", përdoren si pikë fillimi për polimerazën. Primerët janë pjesë të vogla të ADN-së të bëra nga njeriu (oligomers), zakonisht midis 15 dhe 30 nukleotide. Ato janë bërë duke ditur ose duke supozuar sekuenca të shkurtra të ADN-së në skajet e gjenit që po amplifikohen. Gjatë PCR, ADN-ja që sekuestrohet ndizet dhe fijet e dyfishta ndahen. Pas ftohjes, abetaret lidhen me shabllonin (të quajtur annealing) dhe krijojnë një vend për fillimin e polimerazës.
Teknika e PCR
Reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) është bërë i mundur nga zbulimi i thermophiles dhe enzima thermophyl polymerase (enzimat që mbajnë integritetin strukturor dhe funksionalitetin pas ngrohjes në temperatura të larta).
Hapat e përfshirë në teknikën e PCR janë si më poshtë:
- Është krijuar një përzierje, me përqëndrime optimale të modelit të ADN-së, enzimës së polimerazës, primereve dhe dNTPs. Aftësia për të ngrohur përzierjen pa denaturimin e enzimës lejon denaturimin e spiralit të dyfishtë të mostrës së ADN-së në temperatura në intervalin 94 gradë Celsius.
- Pas denaturimit, mostra është ftohur në një distancë më të moderuar, rreth 54 gradë, gjë që lehtëson pjekjen (lidhjen) e primerëve tek templatet e ADN-së me bërthamë.
- Në hapin e tretë të ciklit, mostra është riheated në 72 gradë, temperatura ideale për Taq DNA Polymerase, për zgjatjen. Gjatë zgjatjes, polimeraza e ADN-së përdor fillesë origjinale të ADN-së si një shabllon për të shtuar dNTP-të plotësuese në skajet 3 'të secilës abetare dhe të gjenerojë një seksion të ADN-së me dy brazdat në rajonin e gjenit me interes.
- Pllakat që kanë pjekur në sekuencat e ADN-së që nuk janë një ndeshje e saktë, nuk mbesin annealed në 72 gradë, duke kufizuar kështu zgjatjen e gjenit me interes.
Ky proces i denatyrimit, pjekjes dhe zgjatjes përsëritet (30-40) herë, duke rritur në mënyrë eksponenciale numrin e kopjeve të gjenit të dëshiruar në përzierje. Edhe pse ky proces do të jetë mjaft i lodhshëm nëse kryhet manualisht, mostrat mund të përgatiten dhe inkubohen në një Thermocycler programueshëm, tani i zakonshëm në shumicën e laboratorëve molekulare dhe një reaksion i plotë i PCR mund të kryhet në 3-4 orë.
Çdo hap denaturues ndalon procesin e zgjatjes së ciklit të mëparshëm, duke prerë kështu fillesë të re të ADN-së dhe duke e mbajtur atë afërsisht madhësinë e gjenit të dëshiruar.
Kohëzgjatja e ciklit të zgjatjes mund të bëhet më e gjatë ose më e shkurtër në varësi të madhësisë së gjenit të interesit, por përfundimisht, nëpërmjet cikleve të përsëritura të PCR, shumica e templates do të kufizohen vetëm në madhësinë e gjenit të interesit, do të jenë gjeneruar nga produktet e të dyja primereve.
Ka disa faktorë të ndryshëm për PCR të suksesshëm që mund të manipulohen për të përmirësuar rezultatet. Metoda më e përdorur gjerësisht për të testuar praninë e produktit PCR është elektroforeza e agarozës . Cili përdoret për të ndarë fragmente të ADN-së në bazë të madhësisë dhe ngarkesës. Fragmentet pastaj vizualizohen duke përdorur ngjyra ose radioizotopet.
Evolucioni
Që nga zbulimi i PCR, polimeraza e ADN-së përveç Taq origjinale janë zbuluar. Disa prej tyre kanë aftësi më të mirë "bërthamore" ose janë më të qëndrueshme në temperatura më të larta, duke përmirësuar kështu specifikën e PCR dhe reduktimin e gabimeve nga futja e dNTP të pasaktë.
Disa ndryshime të PCR janë projektuar për aplikime specifike dhe tani përdoren rregullisht në laboratorët gjenetikë molekularë. Disa prej tyre janë PCR në kohë reale dhe PCR kundërtranskriptazës. Zbulimi i PCR ka çuar gjithashtu në zhvillimin e sekuencimit të ADN-së, gjurmët e gishtave të ADN-së dhe teknika të tjera molekulare.