Sekuenca e ADN-së është gjithashtu e varur nga aftësia jonë për të përdorur elektroforetën e xhelit në fijet e veçanta të ADN-së që ndryshojnë në madhësi sa më pak se një palë bazë.
Sekuenca e ADN-së
Në fund të viteve 1970, u zbuluan dy teknika të sekuencimit të ADN-së për molekulat më të gjata të ADN-së. Këto ishin metodat Sanger (ose dideoxy) dhe metodë Maxam-Gilbert (ndarje kimike). Metoda Maxam-Gilbert bazohet në shkrirjen specifike të nukleotideve nga kimikatet dhe përdoret më së miri për sekuencën e oligonukleotideve (polimeret e shkurtër nukleotide, zakonisht më të vogla se 50 palë bazë në gjatësi). Metoda Sanger është përdorur më shpesh sepse është provuar teknikisht më e lehtë për t'u aplikuar dhe, me ardhjen e PCR dhe automatizimin e teknikës, aplikohet lehtësisht në fijet e gjata të ADN-së, duke përfshirë edhe disa gjene të tëra. Kjo teknikë bazohet në përfundimin e zinxhirit nga dideoksinukleotidet gjatë reaksioneve të zgjerimit të PCR.
Metoda Sanger
Në metodën Sanger, filamenti i ADN-së që do të analizohet përdoret si një template dhe polimeraza e ADN-së përdoret, në një reaksion PCR, për të prodhuar fije kompliment duke përdorur primers.
Janë përgatitur katër përzierje të ndryshme të reagimit PCR, ku secila përmban një përqindje të caktuar të analogëve të dideoksinukleozid trifosfat (ddNTP) në një nga katër nukleotidet (ATP, CTP, GTP ose TTP). Sinteza e fijeve të reja të ADN-së vazhdon derisa një nga këto analoge të inkorporohet, në të cilin kohë foleja është e prerë para kohe.
Çdo reaksion PCR do të përfundojë duke përmbajtur një përzierje të gjërave të ndryshme të fijeve të ADN-së, të gjitha duke përfunduar me nukleotid që ishte dideoksi etiketuar për atë reaksion. Elektroforeza e geleve përdoret pastaj për të ndarë fijet e katër reaksioneve, në katër korsi të ndara dhe për të përcaktuar sekuencën e shabllonit origjinal bazuar në atë se gjatësia e fijeve përfundon me atë nukleotid.
Në reagimin e automatizuar të Sanger përdoren abetare të etiketuara me katër etiketa fluoreshente me ngjyra të ndryshme. Reaksionet e PCR, në prani të nukleotideve të ndryshme dideoksi, kryhen siç përshkruhet më sipër. Megjithatë, më pas, katër përzjerjet e reagimit pastaj kombinohen dhe aplikohen në një korsi të vetme të një xhel. Ngjyra e secilit fragment zbulohet duke përdorur një rreze lazer dhe informacioni mblidhet nga një kompjuter i cili prodhon kromatograma që paraqesin majat për secilën ngjyrë, nga e cila mund të përcaktohet sekuenca e ADN-së së templates.
Në mënyrë tipike, metoda e automatizuar e sekuencimit është e saktë vetëm për sekuenca deri në maksimum prej rreth 700-800 bazave-palë në gjatësi. Megjithatë, është e mundur që të marrin sekuenca të plota të gjeneve më të mëdhenj dhe, në fakt, gjenoma të tërë, duke përdorur metoda të hapura si Primer Walking dhe Shotgun sequencing.
Në Primer Walking , një pjesë e zbatueshme e një gjeni më të madh është sekuencuar duke përdorur metodën Sanger. Abetuesit e rinj gjenerohen nga një segment i besueshëm i sekuencës dhe përdoren për të vazhduar sekuencimin e pjesës së gjenit që ishte jashtë intervalit të reagimeve origjinale.
Sekuenca e shotgunit përfshin rastësisht prerjen e segmentit të ADN-së me interes në fragmente më të përshtatshme (të menaxhueshme), duke sekuencuar çdo fragment dhe duke rregulluar pjesët në bazë të sekuencave të mbivendosura. Kjo teknikë është bërë më e lehtë nga aplikimi i softuerit kompjuterik për rregullimin e copave të mbivendosura.